| Περιγραφή: |
Дуб Фрайнетто (Quercus frainetto Ten.) (секц. Quercus) относится к группе европейских робуроидных дубов. Этот южноевропейский вид широко распространен на юге Италии, на Балканском полуострове, в Венгрии и Румынии, а также в Малой Азии (Меницкий, 1984; Yurukov, Zhelev, 2001). В Болгарии Q. frainetto является одной из основных лесообразующих пород. Данные о популяционно генетическом разнообразии этого вида на Балканском полуострове отсутствуют. Цель исследования: описание генетической структуры Q. frainetto на территории Болгарии различными типами генетических маркеров, в сравнении с другими близкородственными видами робуроидных дубов. Предполагалось решение следующих задач: 1) изучение изменчивости 18 ядерных микросателлитных локусов (nSSR) в популяциях Q. frainetto, оценка возможности надежного разграничения вида на основе данного набора nSSR; 2) определение степени дифференциации, гибридизации и генетического потока между Q. frainetto и близкородственными таксонами, 3) описание филогеографической структуры и внутривидовой дифференциации популяций Q. frainetto. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Проанализировано четыре популяции (95 образцов) из различных районов Болгарии (табл. 1). Выделение ДНК проводилось СТАB методом из высушенных в силикагеле листьев. Для сравнения были взяты популяции дуба пушистого (Q. pubescens Willd.), дуба скального (Q. petraea (Matt.) Liebl.), дуба черешчатого (Q. robur L.), рильского дуба (Q. protoroburoides Donch. and Bouz. ex Tash. and Tsavk.) и дуба Гартвиса (Q. hartwissiana Stev.), произрастающих симпатрически с Q. frainetto во многих районах Болгарии. Для исследования генетической структуры были использованы ядерные микросателлитные локусы (nSSR). Проведен анализ изменчивости 18 nSSR локусов из двух мультиплексов (по 8 и 10 локусов), взятых из работы (Guichoux et al., 2011). Условия амплификации описаны в работе (Semerikova et al., 2024). Образцы анализировались на автоматическом секвенаторе Нанофор 05 в Центре коллективного пользования «Современные технологии экологических исследований» ИЭРиЖ УрО РАН. Хроматограммы преобразовывали в генотипические данные с помощью программы GeneMapper 3.5 (Applied Biosystems). С помощью программы GenAlEx v. 6.5 (Peakall, Smouse, 2012) были рассчитаны показатели изменчивости в популяциях. На основе парных межпопуляционных FST проведен анализ главных координат (РСоА). Байесовскую кластеризацию генотипов проводили с помощью программы STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard et al., 2000). Для описания филогеографической структуры исследована изменчивость матерински наследуемых маркеров хлоропластной ДНК. Для генотипирования были использованы четыре хлоропластных микросателлитных локуса (cpSSR): μdt1, μdt3, μdt4, μcd4 (Deguilloux et al., 2003; Семерикова и др., 2021), для которых ранее было показано наличие изменчивости у дуба черешчатого на Балканах и у нескольких видов сидячецветных дубов в Крыму и на Кавказе (Семерикова и др., 2023а, 2023б). ПЦР продукты cpSSR локусов разделялись с помощью вертикального электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле, с последующим серебряным окрашиванием. Всего проанализировано 94 образца Q. frainetto. Все выявленные cpSSR гаплотипы были секвенированы по пяти хлоропластным фрагментам (ASq, CDq, TFq, trnH psbA и trnK matK) общей длиной ~10500 пар нуклеотидов. Редактирование нуклеотидных последовательностей проводили в программе BioEdit (Hall, 1999). Для определения филогенетических соотношений гаплотипов была построена сеть гаплотипов в программе NETWORK (Bandelt et al., 1999), с привлечением данных других исследований (Семерикова и др., 2023а, b). При построении филогенетических деревьев применялись байесовский подход и метод максимальной экономии. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Все nSSR локусы показали успешную амплификацию и высокую изменчивость в популяциях Q. frainetto. Суммарно в четырех популяциях по 18 локусам было обнаружено 389 аллелей. Показатели изменчивости в популяциях Q. frainetto (средняя гетерозиготность He =0.652 (0.641 – 0.660)) были ниже, чем у других широко распространенных таксонов (Q. pubescens, Q. petraea, Q. robur), и находились примерно на уровне изменчивости Q. hartwissiana и Q. protoroburoides. Использованные nSSR локусы хорошо диагностируют таксономическую принадлежность Q. frainetto. Метод байесовской кластеризации STRUCTURE выделил кластер, соответствующий Q. frainetto, который преобладал у всех образцов, отнесенных к данному виду на основании морфологических признаков. Гибридные образцы (предположительно F1) с Q. frainetto выявились у трёх индивидуумов – в двух выборках Q. pubescens и одной выборке Q. hartwissiana. Анализ STRUCTURE и генетических дистанций (парных FST) показал близость Q. frainetto к другим сидячецветным дубам Болгарии (Q. pubescens, Q. petraea), и значительную дифференциацию от длинноплодоносных видов (Q. robur, Q. protoroburoides, Q. hartwissiana). Дифференциация популяций внутри Q. frainetto по ядерным маркерам была низкой, географическая структура не выявлена. Данный набор микросателлитных локусов, впервые примененный для Q. frainetto, может быть использован для исследования популяций этого вида в Европе. Установлено соответствие наборов аллелей cpSSR локусов с данными секвенирования. Получены нуклеотидные последовательности для шести образцов четырех cpSSR гаплотипов из разных популяций. В результате работы в популяциях Q. frainetto выявлено четыре хлоропластных гаплотипа, принадлежащих к двум дивергентным филогенетическим линиям. Состав гаплотипов в популяциях приводится в таблице. Наблюдается географическая дифференциация популяций по составу гаплотипов. В западной части Болгарии преобладает гаплотип J, встречены гаплотипы N, S`. В центральной части, во Фракийской низменности, преобладает гаплотип S`. Популяция с гаплотипом A I расположена территориально ближе к предгорью гор Родопы, где у других видов дубов распространен гаплотип A I. Установлено, что полиморфизм хлоропластной ДНК у исследованных видов дуба не связан с таксономический принадлежностью. У других видов робуроидных дубов хпДНК гаплотипы совпадали с Q. frainetto по регионам. |