Academic Journal
Применение рекомбинантных штаммов Mycobacterium neoaurum в одностадийной трансформации фитостерина в тестостерон
| Τίτλος: | Применение рекомбинантных штаммов Mycobacterium neoaurum в одностадийной трансформации фитостерина в тестостерон |
|---|---|
| Πηγή: | IX Всероссийская Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». |
| Στοιχεία εκδότη: | Crossref, 2024. |
| Έτος έκδοσης: | 2024 |
| Θεματικοί όροι: | гетерологичная экспрессия, фитостерин, биотрансформация стероидов, тестостерон, миколицибактерии, 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа, 17β-гидроксистероиддегидрогеназа |
| Περιγραφή: | Тестостерон (ТС) – андрогенный стероидный гормон, регулирующий рост скелета, повышающий плотность костей и количество мышечной массы, усиливающий обмен микро- и макроэлементов. ТС востребован и широко используется в медицине, а также является предшественником для других стероидных соединений. Тестостерон в настоящее время синтезируют химическим путем в 4 стадии из биотехнологически полученных андрост-4-ен-3,17-диона (АД) или андрост-1,4-диен-3,17-диона (АДД). Однако существуют быстрорастущие непатогенные актинобактерии рода Mycolicibacterium (M. smegmatis, M. fortuitum и M. neoaurum) способные окислять боковую цепь стеринов, а также трансформировать стероидное ядро (Donova, 2023). Наличие в клеточной стенке миколовых кислот является крайне важным для активного транспорта и биодоступности стеринов для клеток. Разрабатываются подходы микробиологического получения ТС из растительных стеринов, но при низкой нагрузке субстратов – до 5,0 г/л. 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа (КстД) катализирует депротонирование C1(α) и C2(β) в кольце А и является ключевыми в превращении АД в АДД. Искусственным генетическим нокаутом гена kstD был создан штамм M. neoaurum NRRL B-3805 ΔkstD (Loraine, Smith, 2017). Делеция гена kstD должна приводить к накоплению в основном АД в ходе окисления алифатической цепи фитостерина. Однонуклеотидная замена в гене kstD, определяет преимущественное накопление АД штаммом M. neoaurum Ас-1815D и, напротив, АДД штаммом Ас-1816D (Tekucheva et al., 2022). Целью настоящей работы являлась разработка эффективного одностадийного способа получения ТС из фитостерина (ФС, 5 – 20 г/л) с использованием рекомбинантных штаммов M. neoaurum, ко-экспрессирующих гены 17β-гидроксистероиддегидрогеназы (ГСД) гриба Cochliobolus lunatus и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФД) Mycobacterium tuberculosis. Сконструированная плазмида pMVN25 (рис. 1) позволила осуществить совместную конститутивную экспрессию синтетических генов, кодирующих 17β-ГСД и Г6ФД. Созданные рекомбинанты M. neoaurum ВКМ Ас-1816D (pMV261N) (1816 N25), ВКМ Ас-1815D (pMV261N) (1815 N25), NRRL B-3805 ΔkstD (pMV261N) (B-3805D N25) не отличались от родительских штаммов по скорости роста в жидкой среде (не приведено). При проведении процесса в режиме активной аэрации (окислительный этап) доминантным продуктом у штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-1816D и 1816 N25 был АДД, его концентрация достигала 65 и 58% (мол.) соответственно. Более низкое накопление АДД при использовании 1816 N25 связано с одновременным восстановлением АДД до дТ уже на этом этапе. При снижении уровня аэрации (восстановительный режим) наблюдалось активное накопление ТС у родительского (Ас-1816D), и равного количества Т и дТ у рекомбинантного (1816 N25) штаммов. У штаммов M. neoaurum ВКМ Ас-1815D и NRRL B-3805 ΔkstD основным промежуточном продуктом окисления фитостерина являлся АД. У родительских штаммов его выход в конце окислительного этапа был выше, чем у соответствующих рекомбинантных штаммов, для которых уже на этом этапе наблюдалось накопление ТС, что свидетельствует о повышенной 17-оксостероид-редуктазной активности рекомбинанта. Достигнутые с помощью штаммов 1815 N25 и B-3805D N25 выходы и титры Т составили 47,7 и 49,5% (мол.) и 1,6–1,7 г/л соответственно. Фитостерин утилизировался практически полностью при исходной концентрации 5 г/л (95–99%) и на 75–82% при нагрузке 20 г/л, что говорит о снижении степени биоконверсии фитостерина при увеличении его начальной концентрации у всех изучаемых штаммов. Однако, достигаемые титры ТС при биоконверсии 20 г/л фитостерина превышали полученные при внесении фитостерина в концентрации 5 г/л и составили 3,7, 4,1 и 4,4 г/л при использовании штаммов 1816 N25, Ас-1815D и B-3805 ΔkstD соответственно. Синтетические гены, кодирующие 17β-ГСД из Cochliobolus lunatus (17beta-HSDCl) и бактериальную Г6ФДГ 2 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (G6PDMt2), были клонированы в векторе pMV261N под контролем конститутивного промотора Phsp60. Плазмида содержит кассету устойчивости к канамицину (KanR) и точки начала репликации в клетках E.coli (oriE) и микобактериях (oriM). Таким образом, введение в лабораторные штаммы M. neoaurum NRRL B-3805 ΔkstD, Ас-1815Д и Ас-1816Д бицистронной генетической конструкции с гетерологичными генами 17β-ГСД и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, регулируемыми конститутивным промотором, способствует повышению выхода 17β-восстановленных продуктов (ТС и дегидротестостерона). Полученные данные расширяют знания о физиологии стероидного метаболизма и открывают перспективы селективного синтеза тестостерона из природных растительных стеринов в одностадийном биотехнологическом процессе при высоких нагрузках субстрата. |
| Τύπος εγγράφου: | Article Conference object |
| Γλώσσα: | Russian |
| DOI: | 10.34756/geos.2023.17.38741 |
| Αριθμός Καταχώρησης: | edsair.doi...........4a953343e82e5e474a57d364c21e19fe |
| Βάση Δεδομένων: | OpenAIRE |
| DOI: | 10.34756/geos.2023.17.38741 |
|---|