| Περιγραφή: |
Яичник – парный орган репродуктивной системы самок млекопитающих. Большое значение для оценки его функционального состояния имеют морфологические методы – широкая группа подходов к изучению внешнего и внутреннего строения биологических объектов. При изучении яичника предпочтение часто отдают гистологическим методам, позволяющим сохранять клеточность органа и анализировать микроструктуру ткани (например, подсчитывать фолликулы и желтые тела беременности и выявлять патоломорфологические изменения) (Волкова, Боровая, 1990; Бессалова,2006). Минус этого метода – длительная и трудоемкая пробоподготовка. В настоящее время активно развиваются экспериментальные морфологические методы. Один из них – сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) – метод изучения поверхностной структуры объекта путем анализа отраженного «электронного изображения». Важным преимуществом СЭМ перед световой микроскопией является получение объемных изображений с разрешением до 1 нм и информации о структуре верхнего слоя, рельефе и фазовых различиях поверхности, а также возможность качественной (в некоторых случаях и количественной) оценки пространственных характеристик органа и его структур(Погорелова и др., 2016). Некоторые методы СЭМ также требуют сложной подготовки образца – предварительного обезвоживания или фиксации, а также напыления токопроводящим слоем (Electron microscopy, 2014). Биологическая ткань обладает низкой контрастностью за счет наличия в ее составе атомов элементов с небольшим количеством электронов, которые уменьшают эффективность взаимодействия образца с электронным пучком, поэтому необходимо использование веществ, увеличивающих контрастность поверхности. При этом контрастирующие вещества могут быть токсичными для биоматериала (Кравчик, Новиков,2021). И.А. Новиков с соавт. (2015) разработали новый подход к подготовке образцов мягких тканей (на примере эпителия роговицы человека), позволяющий значительно сократить ее время и изучать структуру и ультраструктуру с наименьшими искажениями. Его суть заключается в использовании в качестве контрастирующего вещества изотонического водного раствора одного из хлоридов редкоземельных элементов (в частности хлорида неодима – NdCl3) или их смеси. В присутствии редкоземельных элементов не происходит мгновенной гибели и лизиса клеток, а токсический эффект на клеточном уровне приводит к апоптозу, что подтверждает их включенность в метаболические цепочки клетки и позволяет использовать в качестве суправитального красителя (Новиков и др., 2016, 2018). Мы попытались оценить возможности СЭМ с использованием суправитального контрастирования для исследования поверхностной структуры и пространственных характеристик яичника мышевидных грызунов. Исследовали яичники животных из природных популяций – рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) и малой лесной мыши(Sylvaemus uralensis). Для эксперимента отбирали оба яичника у самок на разных стадиях полового развития (неполовозрелые, беременные, с инволюцией желтых тел беременности). После извлечения каждый яичник (образец) промывали в изотоническом растворе NaCl (ГРОТЕКС, Россия) в течение 1–2 мин., затем экспонировали в изотоническом растворе NdCl3 (ВЕКТОН, Россия) и промывали в дистиллированной воде в течение 1–10 сек. Время экспонирования в NdCl3 варьировали от 20 мин. до 6 часов, однако на качество контрастирования продолжительность химической фиксации не влияла. После промывания образец размещали на предметном столике сканирующего микроскопа (VEGA \\ SBU, Tescan, Czech Republic).Для исследования различных характеристик поверхностной структуры яичника использовали детекторы SE и BSE. Комбинация нескольких детекторов и режимов вакуума в устройстве создает разноформатные изображения за счет большего или меньшего вклада одного из параметров (Makabe et al., 1992). Для того, чтобы сохранить часть образцов для световой микроскопии, один яичник из пары просматривали в режиме низкого и высокого вакуума (при ускоряющем напряжении15–30 кВ), другой – только низкого (см. рис. 1). После использования режима низкого вакуума образец снова помещали в физиологический раствор, а затем в гистологический фиксатор (10% формалин). В результате мы пришли к выводу, что химическая фиксация яичника с помощью хлорида неодима позволяет отказаться от избыточных этапов пробоподготовки для СЭМ и получить информацию о структуре органа, которую можно сочетать с информацией, полученной другими методами. |