Academic Journal
Мутации в С-концевом домене H+-АТФазы плазматической мембраны дрожжей Saccharomyces cerevisiae: влияние на ее функционирование
| Τίτλος: | Мутации в С-концевом домене H+-АТФазы плазматической мембраны дрожжей Saccharomyces cerevisiae: влияние на ее функционирование |
|---|---|
| Πηγή: | VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». |
| Στοιχεία εκδότη: | Crossref, 2024. |
| Έτος έκδοσης: | 2024 |
| Θεματικοί όροι: | ДРОЖЖИ, АТФАЗА, КАТАЛИТИЧЕСКОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ, МЕТАБОЛИЗМ ГЛЮКОЗЫ |
| Περιγραφή: | Одним из жизненно важных ферментов дрожжевой клетки является АТФаза плазматической мембраны (РМА1), кодируемая геном РМА1, нокаут которого для клетки летален. Этот фермент гидролизует АТФ с образованием макроэргического интермедиата, в результате чего происходит каталитическое фосфорилирование консервативного остатка Asp-378, и создаёт электрохимический градиент ионов водорода (ΔμH+), энергия которого используется для активного вторичного транспорта веществ. Функционирование АТФазы и ее регуляция тесно связаны с метаболизмом глюкозы: при добавлении глюкозы к клеткам фермент активируется; при этом происходит регуляторное фосфорилирование молекулы АТФазы. В основном фосфорилируются остатки Ser, был также обнаружен фосфотреонин (Chang, Slayman, 1991). Предполагается, что в процессе созревания фермента и его внутриклеточного трафика фосфорилируются около 10 аминокислотных остатков, из которых точно установлены только три (Lecchi et al., 2005, 2007; Mazon et al., 2015). Важным доменом этого фермента является С-концевой участок молекулы, являющийся регуляторным; глюкозо-зависимая регуляция активности H+-АТФазы дрожжей («глюкозный эффект») связана с фосфорилированием расположенных там остатков Ser-911 и Thr-912 (Lecchi et al., 2005, 2007); вовлеченность остальных потенциальных фосфосайтов в этот процесс до настоящего времени не установлена. Таким образом, представлялось важным выяснить, влияют ли замены других потенциально фосфорилируемых остатков, расположенных в С-концевой части фермента на его активность и регуляцию. Было выбрано несколько таких остатков, находящихся в короткой экстрацитозольной петле 846-SENWTD, проведен аланин-сканирующий мутагенез и получены мутанты S846A, E847A, T850A и D851A. РМА1 АТФаза синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме и через аппарат Гольджи и секреторные везикулы достигает плазматической мембраны. На этом секреторном пути находятся пункты контроля качества и если фолдинг фермента был серьезно нарушен, такой белок отбраковывается. Поэтому было важно оценить, влияют ли введенные мутации на экспрессию фермента в плазматических мембранах и, как следствие, на его биогенез. Как видно из табл. 1, биогенез мутантных ферментов не был серьезно нарушен. Для того, чтобы оценить, как функционирует фермент, имеющий замены изучаемых остатков, дикая и мутантные формы фермента были экспрессированы на уровне плазматической мембраны и была измерена АТФазная активность препаратов плазматических мембран, выделенных из голодающих клеток и клеток, метаболизирующих глюкозу (табл. 1). Базовая активность АТФазы мутантных штаммов наиболее выраженно отличалась от таковой дикого типа в случае S846A (увеличение) и D851A (уменьшение, табл. 1). В остальных случаях базовая активность менялась незначительно. На основании этих данных можно предположить, что в штамме S846A АТФаза частично активирована даже в отсутствие глюкозы, в то время как мутация D851A приводила к снижению активности фермента. Присутствие глюкозы приводило к более выраженному влиянию замен на функционирование АТФазы. В штамме с заменой S846A глюкозный эффект был ясно выражен и уровень активности фермента при сбраживании глюкозы даже превышал таковой у родителя; однако, вследствие того, что базовая активность мутанта была выше родительской, степень активации мутантного фермента S846A была несколько ниже, чем у родителя (3,5 и 4,5 раза, соответственно; табл. 1). У трех других мутантных ферментов (E847A, T850A и D851A) уровень гидролиза АТФ в активированном состоянии был ниже более чем в два раза по сравнению с диким типом. Это может указывать на изменения во взаимодействия молекулы АТФазы, несущей замены, с липидным микроокружением, различными частями фермента и/или соседними белками. Недавно было показано, что молекулы АТФазы образуют гексамер, где мономеры взаимодействуют друг с другом, в частности через фосфорилирующий и регуляторный домены (5-6 Heit et al., 2021; Zhao et al., 2022). Нельзя исключить, что во взаимодействии принимают участие и экстрацитозольные части фермента, в частности, потенциально фосфорилируемые остатки, образующие петлю 846-SENWTD, поэтому такой эффект может быть обусловлен и нарушением фосфорилирования АТФазы. Очевидно, для слаженной работы РМА1 АТФазы необходимо наличие нескольких фосфосайтов, из которых главными являются Ser-911 и Thr-912; при удалении этих фосфосайтов или их замене на фосфосайты другого типа (Ser/Thr –> Asp) происходят масштабные изменения как в функционировании фермента (Lecchi et al., 2005, 2007; Mazon et al., 2015; Tomashevsky, Petrov, 2022), так и в энергетическом метаболизме в целом (Tomashevsky, Petrov, 2022). Данные, представленные в настоящей работе, предполагают, что в общем процессе регуляции участвуют дополнительные фосфосайты, в том числе и изучаемые; при отсутствии этих фософсайтов происходит разсогласованность функционирования РМА1 АТФазы. |
| Τύπος εγγράφου: | Article Conference object |
| Γλώσσα: | Russian |
| DOI: | 10.34756/geos.2022.17.38356 |
| Αριθμός Καταχώρησης: | edsair.doi...........29caabdeff42e2bf2a01b488a9b01bca |
| Βάση Δεδομένων: | OpenAIRE |
| DOI: | 10.34756/geos.2022.17.38356 |
|---|