Academic Journal
Большой С-концевой фрагмент (Met225-Ile412) гемолизина II Bacillus cereus обеспечивает агглютинацию эритроцитов
| Title: | Большой С-концевой фрагмент (Met225-Ile412) гемолизина II Bacillus cereus обеспечивает агглютинацию эритроцитов |
|---|---|
| Source: | Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие». |
| Publisher Information: | Crossref, 2024. |
| Publication Year: | 2024 |
| Subject Terms: | моноклональные антитела, биоинформатика, токсин, укороченные пептиды |
| Description: | Bacillus cereus – условно-патогенная грамположительная анаэробная спорообразующая бактерия, обитающая в различных условиях окружающей среды. Одним из факторов патогенности является гемолитический токсин II, который относится к группе β-складчатых порообразующих токсинов. HlyII B. cereus отличается от других порообразующих наличием С-концевого удлинения из 94 аминокислотных остатков HlyIICTD [1, 2]. C использованием моноклональных антител (МА) против HlyIICTD в очищенных с помощью аффинной хроматографии препаратах HlyII обнаружено несколько усеченных с N-конца белковых продуктов, открытые рамки считывания которых совпадают с рамкой hlyII. Среди выявленных укороченных форм обнаружен продукт из 188 аминокислот массой 21,3 кДа [1]. Этот продукт, названный HlyIILCTD, может существовать как у B. cereus – лизогенного штамма B. thuringiensis [3], так и у B. anthracis. Анализ репрезентативности гена hlyII среди геномов B. cereus, B. anthracis и B. thuringiensis с помощью сервиса PATRIC Comparative Systems выявил отдельные укороченные формы этого гена. Биоинформатический анализ показал, что все гены гемолизина II с нарушенной рамкой считывания и неспособные синтезировать полноразмерный токсин содержат кодирующую последовательность, частично или полностью включающую hlyIIlctd. Сохранение укороченной открытой рамки считывания hlyII позволяет предположить функциональную значимость HlyIILCTD как независимого белкового продукта. С целью изучения механизмов порообразования, а также поиска путей подавления гемолиза HlyII в данной работе получена панель МА против HlyIILCTD, освобожденная от моноклональных антител против HlyIICTD. Сконструировано несколько E. coli штаммов – продуцентов этого полипептида. В качестве антигена для иммунизации был использован HlyIILCTD14579, клонированнный в плазмидный вектор pTSL. Сконструирована плазмида pTSLHlyIILCTD14579, в которой белок HlyIILCTD14579 «слит» с шапероном SlyD, а сам SlyD и шестигистидиновый tag отделены от HlyIILCTD сайтом разрезания TEV-протеазы. Индукция экспрессии синтеза белка в полученном штамме-продуценте E. coli, содержащего pTSLHlyIILCTD14579, позволила получить HlyIILCTD14579, «слитый» с шапероном SlyD, в растворимой форме. Для разделения целевого белка и шаперона использовали обработку белка TEV-протеазой с последующей ионообменной хроматографией. Таким образом, впервые получен очищенный белок HlyIILCTD14579 в растворимой форме. Показано взаимодействие нативного белка HlyIILCTD14579 с эритроцитами кролика in vitro и обнаружена активность, приводящая к агглютинации эритроцитов. Среди отобранных МА обнаружены антитела, способные подавлять гемолитическую активность HlyII. Показано, что HlyIILCTD способен агглютинировать эритроциты кролика [4]. Агглютинация была обратимой, не приводила к лизису эритроцитов, эритроциты сохраняли свою целостность, что подтверждалось отсутствием изменений в адсорбции супернатанта эритроцитов при длине волны 541 нм до и после реакции агглютинации. С-концевой избыток HlyII в 94 аминокислоты не вызывал агглютинации, что указывает на участие (в агглютинации) участка гемолизина II, расположенного между С-концевым доменом и основной частью токсина [1]. Добавление в реакционную смесь МА против HlyIILCTD приводило к подавлению агглютинации эритроцитов кролика при 40-кратном молярном избытке. Часть полученных и очищенных МА ингибировала агглютинацию эритроцитов кролика. Кроме того все МА подавляли гемолиз эритроцитов в разной степени. Агглютинация возможна благодаря многовалентности белков, взаимодействующих с поверхностью клетки. По-видимому, адгезия эритроцитов в присутствии HlyIILCTD происходит за счет наличия двух функциональных сайтов. Ранее мы показали, что HlyIICTD способен связываться с мембранами эритроцитов [2] и эффективно димеризоваться в их присутствии [5]. Можно предположить, что HlyIILCTD вызывает агглютинацию эритроцитов, связываясь с поверхностными гликозаминогликанами через эту пространственную область. На структурах HlyIILCTD и полноразмерного HlyII, предсказанных AlphaFold, эти аминокислоты находятся на поверхности, и вполне вероятно, что полноразмерный токсин HlyII также может взаимодействовать с гликозаминогликанами и обеспечивать агглютинацию эритроцитов. В этом случае лизис клеток не наблюдается. Для определения способности к агглютинации полноразмерным белком HlyII необходимо использовать мутантные формы гемолизина II с нарушением цитолитической функции токсина, поскольку процесс гемолиза может протекать одновременно или опережать агглютинацию эритроцитов. Впервые показанный авторами факт агглютинации эритроцитов фрагментом токсина может иметь значение в функционировании этого токсина. Существует, по крайней мере, два возможных механизма агглютинации эритроцитов, вызванных HlyIILCTD [4]. Работа поддержана грантом РНФ № 22-74-10026. |
| Document Type: | Article Conference object |
| Language: | Russian |
| DOI: | 10.34756/geos.2023.17.38776 |
| Accession Number: | edsair.doi...........064a4914fc2d68a5a24aa43af0687f1c |
| Database: | OpenAIRE |
| DOI: | 10.34756/geos.2023.17.38776 |
|---|