| _version_ |
1828462142956765184
|
| author |
Μιχαηλίδου, Κωνσταντίνα
|
| author2 |
Κοντός, Χρήστος
|
| author_facet |
Κοντός, Χρήστος
Μιχαηλίδου, Κωνσταντίνα
|
| author_sort |
Μιχαηλίδου, Κωνσταντίνα
|
| collection |
DSpace
|
| description |
Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη της ευαίσθητης και ειδικής μοριακής μεθοδολογίας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) προκειμένου να ανιχνευθεί ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes σε δείγματα ωμών λαχανικών. Η επιλογή του συγκεκριμένου μικροο-ργανισμού ορίστηκε γιατί ανήκει στην ομάδα των παθογόνων μικροοργανισμών για τον άνθρωπο ,προκαλώντας το τροφιμογενές νόσημα της λιστερίωσης. Συνιστάται συνεπώς η βελτιστοποίηση των συνθηκών της PCR για την ανίχνευση του ελάχιστου ορίου ανίχνευσης του μικροοργανισμού σε δείγματα τροφίμων. Επιπροσθέτως, στην μελέτη αυτή μέσω της μεθοδολογίας PCR, η οποία περιλαμβάνει τον σχεδιασμό ειδικών εκκινητών και την βελτιστοποίηση των συνθηκών, ενισχύθηκε η ειδική αλληλουχία 451bp του γονιδίου prfA (purative response regulator A), στο οποίο οφείλει την παθογονικότητά της η Listeria monocytogenes. Κατά την μελέτη του ορίου ανίχνευσης του μικοοργανισμού, δείγματα ωμών λαχανικών επιμολύνθηκαν σκοπίμως με κύτταρα L. monocytogenes 1-10 cfu/mL και επωάστηκαν στους 37οC για 2, 4, 8 και 16 ώρες αντίστοιχα σε ρυθμιστικό πεπτονούχο νερό. Χρησιμοποιήθηκε και ένα δείγμα ως θετικός μάρτυρας κι επωάστηκε για 16 ώρες στους 37οC χώρις να επιμολυνθεί το δείγμα. Τα αποτελέσματα μετά την επώαση έδειξαν πως η ανίχνευση του μικροοργανισμού μπορεί να καταστεί δυνατή μετά από τις 4 ώρες επώασης στους 37οC ένω μετά από 16 ώρες η ανάπτυξη του μικροοργανισμού ήταν πολύ πιο ικανοποιητική. Μετά από την επώαση των επιμολυσμένων δειγμάτων, ακολούθησε η διαδικασία απομόνωσης του γενωμικού DNA (Deoxyribonucleic Acid) από τα δείγματα ωμών λαχανικών (200mg) και ο όγκος έκλουσης του για κάθε δείγμα ήταν 150μL. Τα απότελέσματα της βελτιστοποίησης των συνθηκών της PCR αποδεικνύουν πως η ιδανική θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών είναι οι 58 οC ενώ ιδανική συγκέντρωση MgCl2 ,για την αύξηση της καταλυτικής δράσης του ενζύμου της DNA πολυμεράσης είναι τα 2.5mM. Αξίζει να σημειωθεί ότι η εφαρμογή αυτών των βέλτιστων συνθηκών κατά την PCR αραιωμένων δειγμάτων βακτηριακού DNA απέδειξε πως η ανίχνευση του DNA της Listeria monocytogenes είναι δυνατή σε συγκέντρωση 400 αντιγράφων DNA. Τέλος, τα αποτελέσματα τόσο της βελτιστοποί-ησης των συνθηκών της PCR όσο και η έρευση του ελάχιστου ορίου ανιχνευσης του βακτηριακού DNA προσδιορίστηκαν μετά από ηλεκτροφόρεση των προϊόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% ,χρωσμένο με βρωμιούχο αιθίδιο 1μg/mL.
|
| id |
oai:hellanicus.lib.aegean.gr:11610-17539
|
| institution |
Hellanicus
|
| language |
el_GR
|
| publishDate |
2017
|
| record_format |
dspace
|
| spelling |
oai:hellanicus.lib.aegean.gr:11610-175392021-02-16T14:18:49Z Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης Μιχαηλίδου, Κωνσταντίνα Κοντός, Χρήστος Listeria monocytogenes PCR Polymerase chain reaction Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Λιστέρια Listeria monocytogenes (URL: http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh88023278) Polymerase chain reaction (URL: http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh89002539) Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη της ευαίσθητης και ειδικής μοριακής μεθοδολογίας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) προκειμένου να ανιχνευθεί ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes σε δείγματα ωμών λαχανικών. Η επιλογή του συγκεκριμένου μικροο-ργανισμού ορίστηκε γιατί ανήκει στην ομάδα των παθογόνων μικροοργανισμών για τον άνθρωπο ,προκαλώντας το τροφιμογενές νόσημα της λιστερίωσης. Συνιστάται συνεπώς η βελτιστοποίηση των συνθηκών της PCR για την ανίχνευση του ελάχιστου ορίου ανίχνευσης του μικροοργανισμού σε δείγματα τροφίμων. Επιπροσθέτως, στην μελέτη αυτή μέσω της μεθοδολογίας PCR, η οποία περιλαμβάνει τον σχεδιασμό ειδικών εκκινητών και την βελτιστοποίηση των συνθηκών, ενισχύθηκε η ειδική αλληλουχία 451bp του γονιδίου prfA (purative response regulator A), στο οποίο οφείλει την παθογονικότητά της η Listeria monocytogenes. Κατά την μελέτη του ορίου ανίχνευσης του μικοοργανισμού, δείγματα ωμών λαχανικών επιμολύνθηκαν σκοπίμως με κύτταρα L. monocytogenes 1-10 cfu/mL και επωάστηκαν στους 37οC για 2, 4, 8 και 16 ώρες αντίστοιχα σε ρυθμιστικό πεπτονούχο νερό. Χρησιμοποιήθηκε και ένα δείγμα ως θετικός μάρτυρας κι επωάστηκε για 16 ώρες στους 37οC χώρις να επιμολυνθεί το δείγμα. Τα αποτελέσματα μετά την επώαση έδειξαν πως η ανίχνευση του μικροοργανισμού μπορεί να καταστεί δυνατή μετά από τις 4 ώρες επώασης στους 37οC ένω μετά από 16 ώρες η ανάπτυξη του μικροοργανισμού ήταν πολύ πιο ικανοποιητική. Μετά από την επώαση των επιμολυσμένων δειγμάτων, ακολούθησε η διαδικασία απομόνωσης του γενωμικού DNA (Deoxyribonucleic Acid) από τα δείγματα ωμών λαχανικών (200mg) και ο όγκος έκλουσης του για κάθε δείγμα ήταν 150μL. Τα απότελέσματα της βελτιστοποίησης των συνθηκών της PCR αποδεικνύουν πως η ιδανική θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών είναι οι 58 οC ενώ ιδανική συγκέντρωση MgCl2 ,για την αύξηση της καταλυτικής δράσης του ενζύμου της DNA πολυμεράσης είναι τα 2.5mM. Αξίζει να σημειωθεί ότι η εφαρμογή αυτών των βέλτιστων συνθηκών κατά την PCR αραιωμένων δειγμάτων βακτηριακού DNA απέδειξε πως η ανίχνευση του DNA της Listeria monocytogenes είναι δυνατή σε συγκέντρωση 400 αντιγράφων DNA. Τέλος, τα αποτελέσματα τόσο της βελτιστοποί-ησης των συνθηκών της PCR όσο και η έρευση του ελάχιστου ορίου ανιχνευσης του βακτηριακού DNA προσδιορίστηκαν μετά από ηλεκτροφόρεση των προϊόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% ,χρωσμένο με βρωμιούχο αιθίδιο 1μg/mL. In the present study, sensitive and specific molecular polymerase chain reaction (PCR) methodology was developed to detect the microorganism Listeria monocytogenes ,in samples of raw vegetables. The choice of the particular micro-organism was defined, because it belongs to the group of pathogenic microorganisms for humans, causing the food-borne illness of listeriosis. It is therefore recommended to optimize the PCR conditions for detecting the minimum detection limit of this microorganism in food samples. Additionally, in this study using PCR methodology, which involved the design of specific primers and the optimization of conditions, the specific 451 bp sequence of the prfA gene (purative response regulator A) was amplified, in which Listeria monocytogenes owes its pathogenicity. In this study of the detection limit of the microorganism, samples of raw vegetables were deliberately transfected with L. monocytogenes cells 1-10 cfu / mL and incubated at 37 ° C for 2, 4, 8 and 16 hours, respectively, in peptone water buffer. A sample was used as a positive control and incubated for 16 hours at 37 ° C without contaminating cells of the microorganism. Results after incubation showed that detection of the microorganism could be made possible after 4 hours of incubation at 37 ° C while after 16 hours of growth of the microorganism was much more satisfactory. Following the incubation of the transfected samples, the process of isolation of the DNA (Deoxyribonucleic Acid) from raw vegetables samples (200mg) was followed and the elution volume for each sample was 150μL. The PCR optimization results demonstrate that the ideal hybridization temperature of the primers is 58 ° C while an ideal concentration of MgCl2 to increase the catalytic activity of the DNA polymerase enzyme is 2.5mM. It is worth noting that the application of these optimal conditions during PCR diluted bacterial DNA samples has shown that DNA detection of Listeria monocytogenes is possible at a concentration of 400 copies of DNA. Finally, the results of both the optimization of PCR conditions and the determination of the minimum detection limit of bacterial DNA were determined after electrophoresis of the PCR products on a 1.5% agarose gel stained with 1 μg / mL of ethidium bromide. 2017-10-26T12:39:00Z 2017-10-26T12:39:00Z 2017-08-03 https://vsmart.lib.aegean.gr/webopac/List.csp?SearchT1=%CE%9C%CE%B9%CF%87%CE%B1%CE%B7%CE%BB%CE%AF%CE%B4%CE%BF%CF%85%2C+%CE%9A%CF%89%CE%BD%CF%83%CF%84%CE%B1%CE%BD%CF%84%CE%AF%CE%BD%CE%B1&Index1=Keywordsbib&Database=1&SearchMethod=Find_1&SearchTerm1=%CE%9C%CE%B9%CF%87%CE%B1%CE%B7%CE%BB%CE%AF%CE%B4%CE%BF%CF%85%2C+%CE%9A%CF%89%CE%BD%CF%83%CF%84%CE%B1%CE%BD%CF%84%CE%AF%CE%BD%CE%B1&OpacLanguage=gre&Profile=Default&EncodedRequest=*3AO*EC*22*C8Wc*F2*8A7*D3t*91*2F0*80&EncodedQuery=*3AO*EC*22*C8Wc*F2*8A7*D3t*91*2F0*80&Source=SysQR&PageType=Start&PreviousList=RecordListFind&WebPageNr=1&NumberToRetrieve=50&WebAction=NewSearch&StartValue=0&RowRepeat=0&ExtraInfo=&SortIndex=Year&SortDirection=-1&Resource=&SavingIndicator=&RestrType=&RestrTerms=&RestrShowAll=&LinkToIndex= http://hdl.handle.net/11610/17539 el_GR Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Διεθνές http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ 72 σ. application/pdf Λήμνος
|
| spellingShingle |
Listeria monocytogenes
PCR
Polymerase chain reaction
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Λιστέρια
Listeria monocytogenes (URL: http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh88023278)
Polymerase chain reaction (URL: http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh89002539)
Μιχαηλίδου, Κωνσταντίνα
Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| title |
Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| title_full |
Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| title_fullStr |
Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| title_full_unstemmed |
Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| title_short |
Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| title_sort |
ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας pcr για την ανίχνευση της listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης
|
| topic |
Listeria monocytogenes
PCR
Polymerase chain reaction
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Λιστέρια
Listeria monocytogenes (URL: http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh88023278)
Polymerase chain reaction (URL: http://id.loc.gov/authorities/subjects/sh89002539)
|
| url |
https://vsmart.lib.aegean.gr/webopac/List.csp?SearchT1=%CE%9C%CE%B9%CF%87%CE%B1%CE%B7%CE%BB%CE%AF%CE%B4%CE%BF%CF%85%2C+%CE%9A%CF%89%CE%BD%CF%83%CF%84%CE%B1%CE%BD%CF%84%CE%AF%CE%BD%CE%B1&Index1=Keywordsbib&Database=1&SearchMethod=Find_1&SearchTerm1=%CE%9C%CE%B9%CF%87%CE%B1%CE%B7%CE%BB%CE%AF%CE%B4%CE%BF%CF%85%2C+%CE%9A%CF%89%CE%BD%CF%83%CF%84%CE%B1%CE%BD%CF%84%CE%AF%CE%BD%CE%B1&OpacLanguage=gre&Profile=Default&EncodedRequest=*3AO*EC*22*C8Wc*F2*8A7*D3t*91*2F0*80&EncodedQuery=*3AO*EC*22*C8Wc*F2*8A7*D3t*91*2F0*80&Source=SysQR&PageType=Start&PreviousList=RecordListFind&WebPageNr=1&NumberToRetrieve=50&WebAction=NewSearch&StartValue=0&RowRepeat=0&ExtraInfo=&SortIndex=Year&SortDirection=-1&Resource=&SavingIndicator=&RestrType=&RestrTerms=&RestrShowAll=&LinkToIndex=
http://hdl.handle.net/11610/17539
|
| work_keys_str_mv |
AT michaēlidoukōnstantina anaptyxēeuaisthētēsmethodologiaspcrgiatēnanichneusētēslisteriamonocytogenessetrophimaeureiaskatanalōsēs
|