Ανάπτυξη ευαίσθητης μεθοδολογίας PCR για την ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης: - Μιχαηλίδου, Κωνσταντίνα (2017)
Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη της ευαίσθητης και ειδικής μοριακής μεθοδολογίας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) προκειμένου να ανιχνευθεί ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes σε δείγματα ωμών λαχανικών. Η επιλογή του συγκεκριμένου μικροο-ργανισμού ορίστηκε γιατί ανήκει στην ομάδα των παθογόνων μικροοργανισμών για τον άνθρωπο ,προκαλώντας το τροφιμογενές νόσημα της λιστερίωσης. Συνιστάται συνεπώς η βελτιστοποίηση των συνθηκών της PCR για την ανίχνευση του ελάχιστου ορίου ανίχνευσης του μικροοργανισμού σε δείγματα τροφίμων. Επιπροσθέτως, στην μελέτη αυτή μέσω της μεθοδολογίας PCR, η οποία περιλαμβάνει τον σχεδιασμό ειδικών εκκινητών και την βελτιστοποίηση των συνθηκών, ενισχύθηκε η ειδική αλληλουχία 451bp του γονιδίου prfA (purative response regulator A), στο οποίο οφείλει την παθογονικότητά της η Listeria monocytogenes. Κατά την μελέτη του ορίου ανίχνευσης του μικοοργανισμού, δείγματα ωμών λαχανικών επιμολύνθηκαν σκοπίμως με κύτταρα L. monocytogenes 1-10 cfu/mL και επωάστηκαν στους 37οC για 2, 4, 8 και 16 ώρες αντίστοιχα σε ρυθμιστικό πεπτονούχο νερό. Χρησιμοποιήθηκε και ένα δείγμα ως θετικός μάρτυρας κι επωάστηκε για 16 ώρες στους 37οC χώρις να επιμολυνθεί το δείγμα. Τα αποτελέσματα μετά την επώαση έδειξαν πως η ανίχνευση του μικροοργανισμού μπορεί να καταστεί δυνατή μετά από τις 4 ώρες επώασης στους 37οC ένω μετά από 16 ώρες η ανάπτυξη του μικροοργανισμού ήταν πολύ πιο ικανοποιητική. Μετά από την επώαση των επιμολυσμένων δειγμάτων, ακολούθησε η διαδικασία απομόνωσης του γενωμικού DNA (Deoxyribonucleic Acid) από τα δείγματα ωμών λαχανικών (200mg) και ο όγκος έκλουσης του για κάθε δείγμα ήταν 150μL. Τα απότελέσματα της βελτιστοποίησης των συνθηκών της PCR αποδεικνύουν πως η ιδανική θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών είναι οι 58 οC ενώ ιδανική συγκέντρωση MgCl2 ,για την αύξηση της καταλυτικής δράσης του ενζύμου της DNA πολυμεράσης είναι τα 2.5mM. Αξίζει να σημειωθεί ότι η εφαρμογή αυτών των βέλτιστων συνθηκών κατά την PCR αραιωμένων δειγμάτων βακτηριακού DNA απέδειξε πως η ανίχνευση του DNA της Listeria monocytogenes είναι δυνατή σε συγκέντρωση 400 αντιγράφων DNA. Τέλος, τα αποτελέσματα τόσο της βελτιστοποί-ησης των συνθηκών της PCR όσο και η έρευση του ελάχιστου ορίου ανιχνευσης του βακτηριακού DNA προσδιορίστηκαν μετά από ηλεκτροφόρεση των προϊόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% ,χρωσμένο με βρωμιούχο αιθίδιο 1μg/mL.