Academic Journal
Ключевая роль активности Н+-АТФазы плазматической мембраны грибов в продукции вторичных метаболитов
| Title: | Ключевая роль активности Н+-АТФазы плазматической мембраны грибов в продукции вторичных метаболитов |
|---|---|
| Source: | VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». |
| Publisher Information: | Crossref, 2024. |
| Publication Year: | 2024 |
| Subject Terms: | ЦЕФАЛОСПОРИН, ДАУНРЕГУЛЯЦИЯ, ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ, ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА, МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ, БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ КЛАСТЕРЫ, РЕКОМБИНАНТНЫЕ КЛОНЫ |
| Description: | Н+-АТФаза плазматической мембраны Р-типа (PMA) играет важную роль в физиологии мицелиальных грибов [1]. Этот протонный насос генерирует электрохимическую протонно-движущую силу через мембрану, которая управляет энергозависимым поглощением аминокислот, сахаров, нуклеозидов и неорганических ионов [2], а также экспортом вторичных метаболитов (ВМ) [3]. Кроме того, транспорт Н+, опосредованный этим ферментом, способствует регуляции внутриклеточного и поверхностного рН вдоль гиф [4]. Работа бета-лактамных транспортеров также зависит от трансмембранного протонного потенциала, генерируемого в результате PMA-активности [5]. Ранее мы показали, что улучшенный классическими методами продуцент антибиотика цефалоспорина С, штамм Acremonium chrysogenum HY, имеет сниженную PMA-активность, примерно 2 раза, по сравнению с исходным штаммом дикого типа A. chrysogenum WT [6]. Наряду со значительным увеличением выхода цефалоспорина С, в 200–300 раз, у A. chrysogenum HY в процессе улучшения произошли дополнительные физиологические изменения, выражающиеся в общем снижении жизнеспособности и стрессоустойчивости, включая заметное замедление скорости роста на плотных и жидких питательных средах [7], что может быть обусловлено снижением активности PMA [8]. У A. chrysogenum HY не обнаружили изменения на уровне аминокислотной последовательности РМА1 (GenBank No: QDF45217.1, [3]) по сравнению с исходным штаммом дикого типа (GenBank No: KFH44673.1, [10]). Однако в процессе ферментации экспрессия РМА у высокоактивного штамма даунрегулирована, в 2–5 раз. В связи с этим одним из подходов для увеличения продукции цефалоспорина С у A. chrysogenum HY виделось в повышении его жизнеспособности через увеличение PMA-активности. В нашей работе мы увеличили PMA-активность у A. chrysogenum HY за счет введения дополнительной копии гетерологичного гена PMA1 из Saccharomyces cerevisiae. Нам удалялось получить серию рекомбинантных клонов A. chrysogenum HY/PMA1sc с последовательно увеличивающейся PMA-активностью, от ее уровня у A. chrysogenum HY для ее уровня у A. chrysogenum WT и немного выше. Правильную интеграцию дрожжевой PMA1 в плазматическую мембрану мицелиального гриба A. chrysogenum, относящегося к классу сордариоциметов, показали в результате присоединения к последовательности PMA1sc гена желтого флуоресцентного белка (tagYFP) с 3`-конца. Способность такого гибридного белка PMA1sc-tagYFP эффективно выполнять свои функции предварительно продемонстрировали в рекомбинантном штамме S. cerevisiae SY4/PMA1sc-tagYFP (несущим дополнительную копию PMA1 в составе центромерного вектора) на фоне глюкозной инактивации исходной хромосомной копии PMA1, находящейся в штамме S. cerevisiae SY4 под промотором, репрессируемым глюкозой [3]. Для этого одновременно с глюкозной инактивацией экспрессии PMA1, проводили термоактивацию кассеты экспрессии PMA1sc-tagYFP, находящейся под контролем термоиндуцибельного промотора 2HSE, в результате теплового шока. Характерное для гибридных белков PMA1 с цветными флуоресцентными белками «рафтовое» свечение [9] также наблюдали в штамме S. cerevisiae YPH857/PMA1sc-tagYFP, где целевую кассету экспрессировали под контролем TEF1 промотора из Ashbya gossypii. Способность PMA1sc-tagYFP сопрягаться с CefT, MFS-транспортером бета-лактамов из A. chrysogenum, показали в штамме S. cerevisiae YPH857/ PMA1sc-tagYFP/ CefTac-tagYFP. В результате получили неожиданные результаты. Оказалось, что увеличение PMA-активности у A. chrysogenum HY коррелирует со снижением продукции цефалоспорина С. При этом наблюдали пропорциональную зависимость между увеличением PMA-активности и снижением выхода цефалоспорина С. При повышении PMA-активности на 50%, снижение в продукции цефалоспорина С составляло 15–20%, дальнейшее увеличение PMA-активности до 100% и выше приводило к снижению выхода цефалоспорина С до 90%, а фракции мажорных цефемов (дезацетилцефалоспорин С и цефалоспорин С) до 50%. Для объяснения полученных результатов изучили содержание АТФ у A. chrysogenum HY и его рекомбинантных аналогов. Ранее было показано, что у A. chrysogenum HY содержание АТФ снижено, в 3–4 раза по сравнению с исходным штаммом A. chrysogenum WT [6]. Оказалось, что в наших экспериментах экспрессия дополнительной копии PMA1sc под контролем конститутивного промотора gpdA из Aspergillus nidulans приводит к дополнительному снижению уровня клеточного АТФ [3]. Причем снижение АТФ в серии рекомбинантных клонов четко коррелирует в увеличением PMA-активности. У клона AcPS10, для которого наблюдали увеличение PMA-активности до уровня 110–120% от уровня в штамме дикого типа (и в два раза по сравнению с A. chrysogenum HY), снижение ATФ было наибольшим, почти в 10 раз по сравнению с штаммом дикого типа (и более чем в два раза по сравнению с A. chrysogenum HY). После проведения корреляционного анализа между содержанием АТФ, цефалоспорина С и РМА-активностью в штаммах A. chrysogenum HY и вариантах A. chrysogenum HY/PMA1sc показали взаимосвязь между этими тремя переменными. Предложили модель, описывающую пересечение биосинтеза цефалоспорина С и работы РМА на уровне потребления общего субстрата АТФ. Также отдельно изучили последнюю стадию биосинтеза цефалоспорина С, связанную с потреблением АТФ. Показали корреляцию между содержанием компонентов фракции мажорных цефемов, количеством АТФ и РМА-активностью клетки. При снижении АТФ в рекомбинантных клонах до определенного порогового уровня, который оказался равным ~60% от содержания АТФ у A. chrysogenum HY, происходит резкое снижение цефалоспорина С и накопление его предшественника на фоне общего падения фракции этих мажорных для A. chrysogenum цефемов. Для того чтобы определить молекулярные основы полученного феномена, изучили изменение экспрессии генов биосинтетических кластеров (BGCs) бета-лактамов в процессе ферментации A. chrysogenum HY и его рекомбинантных аналогов (0 ч, 48 ч и 120 ч). Оказалось, что биосинтетические гены «ранних» и «поздних» бета-лактамных BGCs (pcbAB, pcbC, cefD1, cefEF и cefG), как и cefR, ген путь-специфического регулятора бета-лактамов, в целом даунрегулированы у рекомбинантных A. chrysogenum HY/PMA1sc по сравнению с исходным высокоактивным штаммом. Причем уровень даунрегуляции тем сильнее, чем больше увеличена РМА-активность. Наряду с этим у рекомбинантных клонов апрегулированы транспортные гены (cefP, cefM и cefT), уровень продукции эндогенной копии PMA не изменен. Наши данные показали, что дополнительное увеличение РМА-активности у высокоактивного продуцента цефалоспорина С приводит к снижению его продукции. Грибная РМА является основным потребителем АТФ клетки, который также используется для биосинтеза цефалоспорина С. Возможно, сниженная РМА-активность у A. chrysogenum HY является спутывающем событием, отобранном в процессе улучшения штамма, которое позволило перенаправить часть АТФ, используемого РМА на нужды целевого биосинтеза. |
| Document Type: | Article Conference object |
| Language: | Russian |
| DOI: | 10.34756/geos.2022.17.38324 |
| Accession Number: | edsair.doi...........ecb9e12f3395036fd41f72f4f1926a10 |
| Database: | OpenAIRE |
| DOI: | 10.34756/geos.2022.17.38324 |
|---|