Academic Journal
Προβολή σε EDS

Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи

Λεπτομέρειες βιβλιογραφικής εγγραφής
Τίτλος: Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи
Πηγή: VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов».
Στοιχεία εκδότη: Crossref, 2024.
Έτος έκδοσης: 2024
Θεματικοί όροι: ХОЛЕСТЕРИН, ОКИСЛЕНИЕ БОКОВОЙ ЦЕПИ, КАТАБОЛИЗМ, МУТАЦИИ, ПРОГЕСТЕРОН, СТЕРИН
Περιγραφή: Прогестерон является стероидным гормоном, вырабатываемым корой надпочечников, яичниками и семенниками млекопитающих. К его функциям относят поддержание беременности и другие репродуктивные функции, сохранение нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, участие в процессах образования и разрушения костной ткани, и стимуляция роста остеобластов. Процесс формирования прогестерона из холестерина протекает в два этапа: трехкомпонентная холестерингидроксилазная/С20-С22-лиазная ферментная система (ХГС) с цитохромом P450scc обеспечивает разрыв алифатической цепи в положении C20-C22 с образованием прегненолона, а 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, окисляет 3β-OH группу до 3-кето, в результате чего формируется прогестерон. Ранее была продемонстрирована способность Mycolicibacterium smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB) с мутациями в генах MSMEG_5228 (3β-гидроксистероиддегидрогеназа), MSMEG_6039 (3-кетостероид-9α-гидроксилаза) и MSMEG_5941 (3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа), несущего плазмидную конструкцию pNS11 с генами компонентов ХГС быка, накапливать и сохранять прогестерон в ходе биоконверсии стеринов. Однако, выход целевого продукта оставался низким вследствие микробной деградации субстрата [1]. Главной задачей по увеличению эффективности продукции прогестерона рекомбинантными микобактериями было предотвращение катаболизма холестерина собственными ферментными системами микобактериального хозяина. В связи с этим осуществлён поиск генов-мишеней, нокаут которых потенциально может позволить ингибировать окисление боковой цепи стеринов. В более ранних исследованиях было описано, что у M. smegmatis имеются как минимум два фермента, инициирующих окисление боковой цепи: CYP125A3 (MSMEG_5995) и CYP142A2 (MSMEG_5918). Они относятся к группе стероидных монооксигеназ и катализируют гидроксилирование стеринов в положении атома углерода C26 [2]. Нокаут генов, кодирующих данные ферменты, снижают скорость деградации боковой цепи холестерина. Целью работы явилось создание рекомбинантных штаммов M. smegmatis mc2155 с делециями в генах окисления боковой алифатической цепи стеринов, гетерологически экспрессирующих гены компонентов ХГС коры надпочечников быка. Для введения делеций был применен метод гомологической рекомбинации, в ходе которого были получены штаммы M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142), M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp125) и M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125). Наличие мутации в целевых генах было подтверждено ПЦР скринингом. Мутантные штаммы продемонстрировали способность к более медленному окислению холестерина в сравнении со штаммом-предшественником. Для дальнейшей работы был выбран M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125), так как скорость катаболизма холестерина собственными ферментами данного штамма была самой низкой. Рекомбинантная плазмида pNS11 методом электропорации была перенесена в компетентные клетки мутантного штамма M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125). Была осуществлена биоконверсия стеринов с использованием M. smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125) (pNS11) в сравнении с ранее полученным рекомбинантным штаммом M. smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB) (pNS11). Холестерин (3 г/л), вносили в культуральную жидкость в виде водного раствора с метил-β-циклодекстрином спустя 36 часов индукции синтеза белков ХГС. Результаты анализа методами ТСХ и ВЭЖХ демонстрируют снижение скорости окисления холестерина и более эффективное накопление прогестерона штаммом M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125) (pNS11). Таким образом, впервые показано, что нокаут генов, кодирующих начальные этапы окисления алифатической боковой цепи стеринов у рекомбинантных миколицибактерий, способствует повышению выхода прогестерона в процессе биоконверсии холестерина. В литературе был также описан дополнительный фермент CYP125A4, способный к С26-гидроксилированию холестерина [3]. Ген MSMEG_3524, кодирующий данный белок, может служить следующей мишенью для проведения мутагенеза с целью получения штамма M. smegmatis, несущего метаболические блоки на уровне окисления боковой цепи стеринов.
Τύπος εγγράφου: Article
Conference object
Γλώσσα: Russian
DOI: 10.34756/geos.2022.17.38313
Αριθμός Καταχώρησης: edsair.doi...........45bb9809b5e6c6c1f5fed9596ee48d2f
Βάση Δεδομένων: OpenAIRE
FullText Text:
  Availability: 0
Header DbId: edsair
DbLabel: OpenAIRE
An: edsair.doi...........45bb9809b5e6c6c1f5fed9596ee48d2f
RelevancyScore: 963
AccessLevel: 3
PubType: Academic Journal
PubTypeId: academicJournal
PreciseRelevancyScore: 963.003723144531
IllustrationInfo
Items – Name: Title
  Label: Title
  Group: Ti
  Data: Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи
– Name: TitleSource
  Label: Source
  Group: Src
  Data: <i>VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов»</i>.
– Name: Publisher
  Label: Publisher Information
  Group: PubInfo
  Data: Crossref, 2024.
– Name: DatePubCY
  Label: Publication Year
  Group: Date
  Data: 2024
– Name: Subject
  Label: Subject Terms
  Group: Su
  Data: <searchLink fieldCode="DE" term="%22ХОЛЕСТЕРИН%22">ХОЛЕСТЕРИН</searchLink><br /><searchLink fieldCode="DE" term="%22ОКИСЛЕНИЕ+БОКОВОЙ+ЦЕПИ%22">ОКИСЛЕНИЕ БОКОВОЙ ЦЕПИ</searchLink><br /><searchLink fieldCode="DE" term="%22КАТАБОЛИЗМ%22">КАТАБОЛИЗМ</searchLink><br /><searchLink fieldCode="DE" term="%22МУТАЦИИ%22">МУТАЦИИ</searchLink><br /><searchLink fieldCode="DE" term="%22ПРОГЕСТЕРОН%22">ПРОГЕСТЕРОН</searchLink><br /><searchLink fieldCode="DE" term="%22СТЕРИН%22">СТЕРИН</searchLink>
– Name: Abstract
  Label: Description
  Group: Ab
  Data: Прогестерон является стероидным гормоном, вырабатываемым корой надпочечников, яичниками и семенниками млекопитающих. К его функциям относят поддержание беременности и другие репродуктивные функции, сохранение нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, участие в процессах образования и разрушения костной ткани, и стимуляция роста остеобластов. Процесс формирования прогестерона из холестерина протекает в два этапа: трехкомпонентная холестерингидроксилазная/С20-С22-лиазная ферментная система (ХГС) с цитохромом P450scc обеспечивает разрыв алифатической цепи в положении C20-C22 с образованием прегненолона, а 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, окисляет 3β-OH группу до 3-кето, в результате чего формируется прогестерон. Ранее была продемонстрирована способность Mycolicibacterium smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB) с мутациями в генах MSMEG_5228 (3β-гидроксистероиддегидрогеназа), MSMEG_6039 (3-кетостероид-9α-гидроксилаза) и MSMEG_5941 (3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа), несущего плазмидную конструкцию pNS11 с генами компонентов ХГС быка, накапливать и сохранять прогестерон в ходе биоконверсии стеринов. Однако, выход целевого продукта оставался низким вследствие микробной деградации субстрата [1]. Главной задачей по увеличению эффективности продукции прогестерона рекомбинантными микобактериями было предотвращение катаболизма холестерина собственными ферментными системами микобактериального хозяина. В связи с этим осуществлён поиск генов-мишеней, нокаут которых потенциально может позволить ингибировать окисление боковой цепи стеринов. В более ранних исследованиях было описано, что у M. smegmatis имеются как минимум два фермента, инициирующих окисление боковой цепи: CYP125A3 (MSMEG_5995) и CYP142A2 (MSMEG_5918). Они относятся к группе стероидных монооксигеназ и катализируют гидроксилирование стеринов в положении атома углерода C26 [2]. Нокаут генов, кодирующих данные ферменты, снижают скорость деградации боковой цепи холестерина. Целью работы явилось создание рекомбинантных штаммов M. smegmatis mc2155 с делециями в генах окисления боковой алифатической цепи стеринов, гетерологически экспрессирующих гены компонентов ХГС коры надпочечников быка. Для введения делеций был применен метод гомологической рекомбинации, в ходе которого были получены штаммы M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142), M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp125) и M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125). Наличие мутации в целевых генах было подтверждено ПЦР скринингом. Мутантные штаммы продемонстрировали способность к более медленному окислению холестерина в сравнении со штаммом-предшественником. Для дальнейшей работы был выбран M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125), так как скорость катаболизма холестерина собственными ферментами данного штамма была самой низкой. Рекомбинантная плазмида pNS11 методом электропорации была перенесена в компетентные клетки мутантного штамма M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125). Была осуществлена биоконверсия стеринов с использованием M. smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125) (pNS11) в сравнении с ранее полученным рекомбинантным штаммом M. smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB) (pNS11). Холестерин (3 г/л), вносили в культуральную жидкость в виде водного раствора с метил-β-циклодекстрином спустя 36 часов индукции синтеза белков ХГС. Результаты анализа методами ТСХ и ВЭЖХ демонстрируют снижение скорости окисления холестерина и более эффективное накопление прогестерона штаммом M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125) (pNS11). Таким образом, впервые показано, что нокаут генов, кодирующих начальные этапы окисления алифатической боковой цепи стеринов у рекомбинантных миколицибактерий, способствует повышению выхода прогестерона в процессе биоконверсии холестерина. В литературе был также описан дополнительный фермент CYP125A4, способный к С26-гидроксилированию холестерина [3]. Ген MSMEG_3524, кодирующий данный белок, может служить следующей мишенью для проведения мутагенеза с целью получения штамма M. smegmatis, несущего метаболические блоки на уровне окисления боковой цепи стеринов.
– Name: TypeDocument
  Label: Document Type
  Group: TypDoc
  Data: Article<br />Conference object
– Name: Language
  Label: Language
  Group: Lang
  Data: Russian
– Name: DOI
  Label: DOI
  Group: ID
  Data: 10.34756/geos.2022.17.38313
– Name: AN
  Label: Accession Number
  Group: ID
  Data: edsair.doi...........45bb9809b5e6c6c1f5fed9596ee48d2f
PLink https://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&site=eds-live&db=edsair&AN=edsair.doi...........45bb9809b5e6c6c1f5fed9596ee48d2f
RecordInfo BibRecord:
  BibEntity:
    Identifiers:
      – Type: doi
        Value: 10.34756/geos.2022.17.38313
    Languages:
      – Text: Russian
    Subjects:
      – SubjectFull: ХОЛЕСТЕРИН
        Type: general
      – SubjectFull: ОКИСЛЕНИЕ БОКОВОЙ ЦЕПИ
        Type: general
      – SubjectFull: КАТАБОЛИЗМ
        Type: general
      – SubjectFull: МУТАЦИИ
        Type: general
      – SubjectFull: ПРОГЕСТЕРОН
        Type: general
      – SubjectFull: СТЕРИН
        Type: general
    Titles:
      – TitleFull: Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи
        Type: main
  BibRelationships:
    IsPartOfRelationships:
      – BibEntity:
          Dates:
            – D: 17
              M: 12
              Type: published
              Y: 2024
          Identifiers:
            – Type: issn-locals
              Value: edsair
          Titles:
            – TitleFull: VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов»
              Type: main
ResultId 1