Academic Journal
Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи
| Title: | Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи |
|---|---|
| Source: | VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». |
| Publisher Information: | Crossref, 2024. |
| Publication Year: | 2024 |
| Subject Terms: | ХОЛЕСТЕРИН, ОКИСЛЕНИЕ БОКОВОЙ ЦЕПИ, КАТАБОЛИЗМ, МУТАЦИИ, ПРОГЕСТЕРОН, СТЕРИН |
| Description: | Прогестерон является стероидным гормоном, вырабатываемым корой надпочечников, яичниками и семенниками млекопитающих. К его функциям относят поддержание беременности и другие репродуктивные функции, сохранение нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, участие в процессах образования и разрушения костной ткани, и стимуляция роста остеобластов. Процесс формирования прогестерона из холестерина протекает в два этапа: трехкомпонентная холестерингидроксилазная/С20-С22-лиазная ферментная система (ХГС) с цитохромом P450scc обеспечивает разрыв алифатической цепи в положении C20-C22 с образованием прегненолона, а 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, окисляет 3β-OH группу до 3-кето, в результате чего формируется прогестерон. Ранее была продемонстрирована способность Mycolicibacterium smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB) с мутациями в генах MSMEG_5228 (3β-гидроксистероиддегидрогеназа), MSMEG_6039 (3-кетостероид-9α-гидроксилаза) и MSMEG_5941 (3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа), несущего плазмидную конструкцию pNS11 с генами компонентов ХГС быка, накапливать и сохранять прогестерон в ходе биоконверсии стеринов. Однако, выход целевого продукта оставался низким вследствие микробной деградации субстрата [1]. Главной задачей по увеличению эффективности продукции прогестерона рекомбинантными микобактериями было предотвращение катаболизма холестерина собственными ферментными системами микобактериального хозяина. В связи с этим осуществлён поиск генов-мишеней, нокаут которых потенциально может позволить ингибировать окисление боковой цепи стеринов. В более ранних исследованиях было описано, что у M. smegmatis имеются как минимум два фермента, инициирующих окисление боковой цепи: CYP125A3 (MSMEG_5995) и CYP142A2 (MSMEG_5918). Они относятся к группе стероидных монооксигеназ и катализируют гидроксилирование стеринов в положении атома углерода C26 [2]. Нокаут генов, кодирующих данные ферменты, снижают скорость деградации боковой цепи холестерина. Целью работы явилось создание рекомбинантных штаммов M. smegmatis mc2155 с делециями в генах окисления боковой алифатической цепи стеринов, гетерологически экспрессирующих гены компонентов ХГС коры надпочечников быка. Для введения делеций был применен метод гомологической рекомбинации, в ходе которого были получены штаммы M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142), M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp125) и M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125). Наличие мутации в целевых генах было подтверждено ПЦР скринингом. Мутантные штаммы продемонстрировали способность к более медленному окислению холестерина в сравнении со штаммом-предшественником. Для дальнейшей работы был выбран M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125), так как скорость катаболизма холестерина собственными ферментами данного штамма была самой низкой. Рекомбинантная плазмида pNS11 методом электропорации была перенесена в компетентные клетки мутантного штамма M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125). Была осуществлена биоконверсия стеринов с использованием M. smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125) (pNS11) в сравнении с ранее полученным рекомбинантным штаммом M. smegmatis mc2155 Δ(hsdD, kstD, kshB) (pNS11). Холестерин (3 г/л), вносили в культуральную жидкость в виде водного раствора с метил-β-циклодекстрином спустя 36 часов индукции синтеза белков ХГС. Результаты анализа методами ТСХ и ВЭЖХ демонстрируют снижение скорости окисления холестерина и более эффективное накопление прогестерона штаммом M. smegmatis Δ(hsdD, kstD, kshB, cyp142, cyp125) (pNS11). Таким образом, впервые показано, что нокаут генов, кодирующих начальные этапы окисления алифатической боковой цепи стеринов у рекомбинантных миколицибактерий, способствует повышению выхода прогестерона в процессе биоконверсии холестерина. В литературе был также описан дополнительный фермент CYP125A4, способный к С26-гидроксилированию холестерина [3]. Ген MSMEG_3524, кодирующий данный белок, может служить следующей мишенью для проведения мутагенеза с целью получения штамма M. smegmatis, несущего метаболические блоки на уровне окисления боковой цепи стеринов. |
| Document Type: | Article Conference object |
| Language: | Russian |
| DOI: | 10.34756/geos.2022.17.38313 |
| Accession Number: | edsair.doi...........45bb9809b5e6c6c1f5fed9596ee48d2f |
| Database: | OpenAIRE |
| DOI: | 10.34756/geos.2022.17.38313 |
|---|